Western Blot 常見問題分析（三）

發布時間：2020/6/2 15:41:05 閱讀次數：1805

前兩周的“Western Blot 常見問題分析”中,我們主要分享了一些異常的實驗結果,今天我們來講講關于Western Blot實驗可能會存在的疑惑.話不多說,直接上貨：

1．Western實驗中,用TBS還是PBS？

選擇合適的緩沖液對于維持一定pH值下蛋白質的穩定及保證實驗的重復性很重要.PBS的緩沖能力強于TBS,TBS在pH7.0以下緩沖能力較弱.一般根據實驗目的選用合適的緩沖液,如在蛋白純化中進行陰離子交換層析,陽離子緩沖液選TBS；陽離子交換層析時,陰離子緩沖液選PBS.Western blot中使用PBS和TBS均可,根據需要選擇合適的濃度.

2. 沒有注明可以用來做Western blot的一抗,可以用來做Western blot嗎？

不一定,因為有的抗體是識別線性表位的,有的是識別構象型表位,識別構象型表位的抗體不能用于Western blot,因為在Western blot中抗體識別的是完全變性的蛋白質抗原,而蛋白質抗原的構象型表位變性時被破壞.

3．做Western每次只加一種一抗,可以同時加兩種或者多種一抗嗎？

不要同時加兩種一抗,因為如果結果里面有非特異性信號的話,就說不清楚.做Western在同一張膜上檢測目的蛋白和內對照,也是先上目的蛋白的一抗二抗 ECL顯色壓片洗片,漂洗后加內對照的一抗二抗 ECL顯色壓片,洗片.

4. Western用的一抗,單抗好些還是多抗好些？

做Western來講,理論上單抗比多抗的特異性要好但價格偏高,一般來說多抗就OK了.用于Western的抗體和用于ELISA的抗體,一般來說用于Western的抗體識別的是氨基酸序列特異性,而可用于ELISA的抗體要看抗原種類,有些是識別氨基酸序列特異性,有些是識別構象特異性,所以一般根據說明書來確定.做免疫印跡選擇抗體主要考慮兩個問題,一是所選抗體是否識別凝膠電泳后轉印至膜上的變性蛋白,另一個是所選抗體是否會引起交叉反應條帶.